濁度法測定12-去羥基阿奇霉素的效價

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2019-01-04

　　【摘要】 目的 建立濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價的方法。方法 以肺炎克雷伯菌為試驗(yàn)菌，加菌量0.6%~1.0%(V/V)，37℃±0.5℃培養(yǎng)4 h左右測定。結(jié)果 抗生素線性濃度為2.0~10.0 U/ml，二劑量法原料的平均回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。結(jié)論 本方法靈敏，快速，影響因素較少，可作為測定12.去羥基阿奇霉素的效價的方法。

　　【關(guān)鍵詞】 效價;濁度法;12.去羥基阿奇霉素

　　12-去羥基阿奇霉素是由紅霉素C為原料，通過化學(xué)合成的方法合成的。本藥物屬廣譜抗菌藥， 對大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌以及細(xì)胞內(nèi)病原菌、支原體和衣原體等有較好的抗菌活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌也有一定的抗菌活性。其抗菌活性較阿奇霉素為強(qiáng)。

　　本藥物屬于新藥，目前尚無含量測定方法。本文建立了濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價的方法。通過對12.去羥基阿奇霉素用比濁法測定其效價的研究，即可直觀反應(yīng)藥物的抗菌活力，又可在檢測當(dāng)天獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　1 儀器與試劑

　　CBZ.1抗生素光度比濁法測量儀、石英培養(yǎng)杯(厚度1 cm)，北京潮聲公司。

　　肺炎克雷伯菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 103]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

　　阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：130352.200405含量：936 U/mg)由中國藥品生物制品檢定所提供。12.去羥基阿奇霉素(河北省藥品檢驗(yàn)所自主合成)。

　　抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(pH7.8，批號060403)由北京三藥科技開發(fā)公司提供(中國藥品生物制品檢定所監(jiān)制);滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)均按中國藥典2005年版二部附錄配制。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 一劑量法

　　2.1.1 菌液的配制 取肺炎克雷伯菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，在35℃~37℃培養(yǎng)18~22 h，臨用時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下;取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 ml殺滅，加生理鹽水做適當(dāng)?shù)南♂專沟闷湓?80 nm波長處的吸收值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數(shù)和1 ml 12%甲醛液的總毫升數(shù)，再將原菌液按此比例稀釋，即為試驗(yàn)菌液。取試驗(yàn)菌液0.6~1.0 ml加至培養(yǎng)基100 ml中，搖勻，為實(shí)驗(yàn)菌液。

　　2.1.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱取，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)進(jìn)一步稀釋成2、4、5、8、10 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　2.1.3 培養(yǎng)與測定 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 ml，加入滅菌培養(yǎng)管中，再加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0 ml，置抗生素比濁法測量儀內(nèi)，于37℃培養(yǎng)。另取稀釋溶劑1.0 ml，加空白培養(yǎng)基9.0 ml，混勻，作為空白對照，儀器在線于530 nm的波長處測定各管肺炎克雷伯菌對數(shù)生長期內(nèi)不同培養(yǎng)時間下的吸光度值(A)。根據(jù)量反應(yīng)平行線原理計算供試品的效價值。

　　2.2 二劑量法

　　2.2.1 溶液的配制 ①標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密量取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;②供試品溶液取12.去羥基阿奇霉素適量，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取12.去羥基阿奇霉素儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的供試品溶液。

　　2.2.2 菌液的配制 同2.1.2項(xiàng)下制備方法。

　　2.2.3 培養(yǎng)與測定 同2.1.3項(xiàng)下方法。

　　2.3 線性與范圍的測定 照抗生素微生物檢定一劑量法測定，并以各組濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致菌液吸收度的值對溶液對數(shù)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：

　　回歸直線方程 Y=bX+a=.0.471 5 X+0.832 6相關(guān)系數(shù)r=0.995 5。

　　結(jié)果表明：采用標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行一劑量法試驗(yàn)，在2~10 U/ml的濃度范圍里，呈良好的線性關(guān)系。

　　2.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品及一批已知含量的12.去羥基阿奇霉素原料樣品，精密稱定，加乙醇溶解并用水稀釋成800、1 000、1 200 U/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成3.2和6.4 U/ml、4.0和8.0 U/ml、5.0和10.0 U/ml的供試品溶液。在上述條件下測定，測得回收率結(jié)果為平均加樣回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。

　　2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 用已知含量的12.去羥基阿奇霉素樣品一批，共測定6次，結(jié)果平均含量為950 U/mg，RSD為1.8%。

　　2.6 穩(wěn)定性考察 主要考察了抗生素溶液，即貯備溶液和測定溶液穩(wěn)定性對測定結(jié)果的影響。

　　結(jié)果表明：本品的濃溶液和點(diǎn)樣用稀溶液放置冰箱保存可穩(wěn)定2 d，完全可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

　　2.7 專屬性考察 采用回收率試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見2.4。

　　2.8 樣品測定 按上述濁度法測定法的二劑量法，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

　　3 討論

　　3.1 測定條件的選擇

　　3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌、培養(yǎng)基及加菌量的選擇 12.去羥基阿奇霉素為廣譜抗生素，對大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌敏感，對革蘭氏陽性細(xì)菌也有一定的抗菌活性。曾選用金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌同時作實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對于本品種來說更為敏感。因此，本研究選擇肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗(yàn)菌。培養(yǎng)基采用國內(nèi)外藥典通用的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號，pH為7.0，滅菌后為澄清的液體培養(yǎng)基，適合肺炎克雷伯菌生長。

　　菌液濃度：比濁側(cè)定時，菌液過濃亦可使?jié)舛?吸收度不成直線關(guān)系;但菌液濃度過稀，則讀數(shù)偏低，誤差增大。一般控制吸收度讀數(shù)在0.3~0.7較為適宜。

　　3.1.2 測定時間的選擇 采用試驗(yàn)菌的不同傳代次數(shù)(3、4、5代)及不同加菌量(0.6~1.0%)，以不同抗生素濃度試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)菌的生長曲線。發(fā)現(xiàn)，在4 h左右可達(dá)到所需濃度范圍(即培養(yǎng)一定時間后，吸光度應(yīng)在0.3~0.7，劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1)。

　　3.1.3 時間的一致性 主要是使每管的培養(yǎng)時間相等，實(shí)驗(yàn)時在試管中加入含試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時可先將培養(yǎng)基冷卻至2℃~4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養(yǎng)基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養(yǎng)終止時原應(yīng)將各管同時放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗(yàn)管的培養(yǎng)時間一致，現(xiàn)采用儀器在線測定，則不需此項(xiàng)操作。

　　3.2 濁度法具有快速(試驗(yàn)過程3~4 h，加上其他操作，可在當(dāng)天獲得結(jié)果)，易于操作，結(jié)果用儀器測定，便于自動化操作等優(yōu)點(diǎn);更重要的是采用液體培養(yǎng)基，消除了多組分抗生素在固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散不同的影響，使得試驗(yàn)的靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度都較瓊脂擴(kuò)散法好。但濁度法對試驗(yàn)儀器的性能及試驗(yàn)器具的要求較高(如：培養(yǎng)溫度要求一致，比色管的清潔等)，另外，任何影響液體培養(yǎng)基內(nèi)微生物生長的因素都會影響抗生素效價的測定，這是其缺點(diǎn)。因此，隨著大量單組分抗生素采用HPLC法測定含量，濁度法將成為不易采用HPLC法的抗生素和多組分抗生素效價測定的主流。12.去羥基阿奇霉素。

　　參考文獻(xiàn)

　　1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2005年版二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:82.

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