動態(tài)濁度法定量檢測清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2019-01-04

　　[摘要] 目的：建立定量檢測清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。方法：采用《中國藥典》2005年版二部附錄中的動態(tài)濁度法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。結(jié)果：用此法檢測時無干擾因素影響，內(nèi)毒素回收率為50%~200%。結(jié)論：使用動態(tài)濁度法定量檢測清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的，此方法既可避免兔熱原檢查法操作復(fù)雜的缺點，同時又避免了限量法檢測內(nèi)毒素時的干擾。

　　[關(guān)鍵詞] 清開靈注射液;細(xì)菌內(nèi)毒素;動態(tài)濁度法;干擾試驗

　　[中圖分類號]R927.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B [文章編號]1673-7210(2009)03(a)-057-02

　　清開靈注射液為中藥注射劑，是安宮牛黃丸的改型制劑。臨床上用于治療熱病神昏、中風(fēng)偏癱、意識不清，也可用于急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸道感染、肺炎、高熱以及腦血栓形成、腦出血見上述癥狀者，其臨床應(yīng)用廣泛、用量大，又為中藥制劑，因而對其進(jìn)行熱原控制具有重要意義。因細(xì)菌內(nèi)毒素限值檢查具有較大的干擾性，而選用動態(tài)濁度法測定細(xì)菌內(nèi)毒素可消除干擾，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。該品種部頒規(guī)定的檢查項是熱原檢查，本法參照《中國藥典》2005版二部附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法，對清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性進(jìn)行探索，旨在建立一種快速檢測該注射液的方法，并對其進(jìn)行添加內(nèi)毒素回收試驗及熱原檢查對比試驗，來證實此法的可行性。

　　1儀器與試藥

　　BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津大學(xué)無線電廠);清開靈注射液(批號20070204、20070607、20070512，河北神威藥業(yè)有限公司);TAL試劑(批號20070206，λ為0.03 EU/ml，規(guī)格0.5 ml/Amp，湛江海洋生物制品檢定廠);細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(批號2007-7，120 EU/Amp，中國藥品生物制品檢定所);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(批號20061208，規(guī)格10 ml/Amp，湛江海洋生物制品檢定廠)。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

　　公式為L=K/M，K為規(guī)定的給藥途徑，即人均每千克體重每小時可接受的最大內(nèi)毒素劑量，注射劑規(guī)格為5.0 EU/kg;M為1 h每千克體重的最大給藥劑量，為10 ml/kg，清開靈注射液的人均最大給藥量為40 ml。中國人的體重按60 kg計，計算得樣品的內(nèi)毒素限值L為7.5 EU/ml。

　　2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

　　用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋240～1 200倍，最終得細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3 EU/ml的系列稀釋溶液;各取0.1 ml分別加入預(yù)先加有0.1 ml TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)進(jìn)行自動檢測，其中每一個濃度重復(fù)3管。結(jié)果見表1。

　　得回歸方程lgT=3.112-0.320 2lgC，其中相關(guān)系數(shù)r=-0.998 6，最低濃度λ1=0.031 3 EU/ml，空白對照管在檢測時間外，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

　　表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)信息

　　2.3干擾試驗

　　2.3.1 樣品稀釋倍數(shù)的計算公式為MVD=(L?C)/λ1。L為清開靈注射液內(nèi)毒素限值，C為1.0 ml/ml，λ1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.031 3 EU/ml，計算得清開靈注射液最大有效稀釋倍數(shù)MVD為240倍。

　　2.3.2 樣品溶液的配制及干擾試驗將清開靈注射液用內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為30、60、120、240倍的溶液，記為A1液;同時，另取4管，進(jìn)行相同倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加濃度為M(4λ1)的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為樣品添加內(nèi)毒素陽性對照管，記為B1液;分別取上述各液0.1 ml，加入預(yù)先加有0.10 ml TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混勻立即插入BET-32C細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀內(nèi)進(jìn)行檢測，其中每一個濃度重復(fù)3管，計算回收率。回收率(%)=(B1液內(nèi)毒素值-A1液內(nèi)毒素值)/M×100%。結(jié)果見表2。

　　樣品添加內(nèi)毒素的平均回收率均在50%~200%范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2005年版有關(guān)規(guī)定，表明樣品的4個不同濃度溶液對TAL無干擾。

　　表 2 清開靈注射液的干擾試驗

　　2.4 樣品溶液的回收率試驗

　　分別取3批清開靈注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成4倍稀釋液，記為A2液;同時，另取4管進(jìn)行4倍稀釋，并在稀釋液中添加濃度為M(4λ1)的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，記為B2液;分別取上述各液0.1 ml，加入預(yù)先加有0.10 ml TAL試劑的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行檢測，其中，每一個濃度重復(fù)3管，計算回收率。結(jié)果見表3。

　　3批清開靈注射液的回收率均在50%~200%范圍內(nèi)，表明清開靈注射液在本實驗條件下對TAL試劑無干擾影響，因此日常檢驗選用240倍即可。

　　表 3 清開靈注射液的回收率試驗

　　同時，進(jìn)行3批供試品的家兔熱原檢查對比試驗，結(jié)果一致，均為陰性。

　　3討論

　　從清開靈注射液的干擾試驗結(jié)果可知，用細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法檢測時，由于內(nèi)毒素回收率在50%~200%范圍內(nèi)，表明不存在干擾因素的影響，且3批清開靈注射液的內(nèi)毒素含量均在規(guī)定限度7.5 EU/ml以下。

　　用傳統(tǒng)的家兔法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，由于操作復(fù)雜、影響因素多，對試驗結(jié)果影響很大;動態(tài)濁度法具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測靈敏度高等優(yōu)點，避免了由于家兔及人為主觀判斷差異所導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果。經(jīng)過對比試驗，樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測結(jié)果與家兔熱原檢測結(jié)果一致，說明使用細(xì)菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法測定清開靈注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的。

　　[參考文獻(xiàn)]

　　[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部(附錄XI E).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.85.

　　[2]EP Supplement[S].2000,41.

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